• 客服
  • 微信








    • SPE & QuEChERS
    • 核酸纯化app下载
    • 过滤器材
    • 样本采集
  • 幸运飞艇生物公众号







Oligo合成柱/板

Embed™核酸合成柱


通用合成柱
全基因合成柱
 

第一代Oligo合成柱


第一代Oligo合成柱

高Loading合成柱


高Loading合成空柱

核酸脱盐柱

离心法脱盐柱


离心法脱盐柱

核酸合成试剂


蛋白层析空柱

亲和层析(AC)空柱


针筒型 串联型
长体型 工具套装  

中压层析(FPLC)空柱


FPLC空柱

 

MXK系列空柱


MXK系列玻璃柱

胶体金优化剂

预染彩虹蛋白marker

预染彩虹蛋白marker


预染彩虹蛋白Marker







































































































































































4Tip™吸头滤芯

Dasang®医疗设备滤芯

制氧机滤芯

制氧机滤芯
制氧机滤芯

定制滤芯

可定制孔径、尺寸及功能

定制滤芯

通用品牌SPE柱及OEM

通用品牌SPE柱

幸运飞艇开奖 通用品牌,预留标签位

中性包装SPE柱




SPE柱OEM服务

为您打造SPE品牌

SPE OEM服务

通用品牌QuEChERS及OEM

通用品牌QuEChERS

通用品牌,预留标签位

中性包装QuEChERS

QuEChERS OEM服务

幸运飞艇开奖 为您打造QuEChERS品牌

OEM服务

核酸纯化app下载OEM

核酸纯化柱OEM

基于硅胶膜法

核酸纯化柱OEM

合成柱OEM

多种规格和应用可选

合成柱OEM


Pfu DNA聚合酶
Pfu DNA聚合酶
Pfu DNA聚合酶
Pfu DNA聚合酶

Pfu DNA聚合酶

供应商货号:P1021,P1022,P1023,P1024

详情

Pfu DNA聚合酶是极端嗜热性细菌Pyrococcus furiosus来源的高度热稳定DNA聚合酶,分子量为90 KD。其保真性是普通Taq DNA聚合酶的10倍左右。扩增片段的长度可达2 kb(简单模板)。延伸速度为2min/kb(70~75℃,简单模板可达20s/kb)。该酶具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性,扩增产物具有平末端。

app下载组成

Component

P1021

250U

P1022

250U

P1023

1,000U

P1024

1,000U
Pfu DNA聚合酶(5U/μl)
50 μl
50 μl
200 μl
200 μl
10× Pfu  Buffer(Mg2+ Plus)[1]
1.25 ml
1.25 ml
1.25 ml × 2
1.25 ml × 2
6× Loading Buffer
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
dNTPs(2.5mM)[2]
-
1 ml
-
1 ml × 2


[1]
10× Pfu Buffer分为Mg2+ Plus与Mg2+ Free两种包装,可方便选择。如无特别说明提供10× Pfu Buffer(Mg2+ Plus)。Mg2+ Free的10×Pfu Buffer提供25 mM MgCl2

[2]dNTPs是dATP、dGTP、dCTP和dTTP等摩尔混合物,P1021/P1023不含dNTPs。

活性定义

一个活性单位(U)指用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物,在72℃、30 min内,摄入10 nmol全核苷酸所需的酶量。

保存条件

-20℃保存2年。

质量控制

纯度检测:经质量检测,app下载不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能检测:PCR方法检测无宿主残余DNA,能有效扩增人基因组中的单拷贝基因。

应用举例

1. 配制反应体系

请于冰上配置反应体系,体系大小与组分用量与添加顺序可调整:

Ordinal
Component

Volume

(50 μl reaction volume)

Final   concentration

(50 μl reaction volume)
1 10× Pfu   Buffer(Mg2+Plus)
5 μl

2 dNTPs(2.5mM)
4 μl
0.4 mM
3 upstream primer (10 μM)[1]
2 μl
0.4 mM
4 downstream primer (10 μM)[1]
μl
0.4 mM
5 Pfu DNA聚合酶(5U/μl)[2]
0.5 μl-1 μl
2.5U-5U
6 template DNA[3]
1-4 μl
<1μg
7 超纯水
To 50 μl
-
optional
MgCl2(MgSO4)/PCR Enhancer
Variable
-

[1] 引物终浓度建议范围:0.1-1 μM。特异性差时可降低浓度,效率低时可提高浓度。

[2] 根据目的片段扩增的难易程度调整DNA聚合酶的用量。

[3] 不同模板最佳用量不同,部分DNA模板建议用量如下表(50 μl反应体系)。

Template
Dosage
人类基因组DNA
0.1μg-1μg
λDNA
0.5ng-5ng
大肠杆菌基因组DNA
10ng-100ng
质粒DNA
0.1ng-10ng

2. 设定反应程序进行PCR反应

Stage
Temperature
Time
Number of Cycles
Initial Denaturation
94℃
3 min
1
Denaturation
94℃
30 sec
25-35
Annealing
55-68℃[1]
30 sec
Extension
72℃[2]
Variable[2]
Final Extension
72℃
5-10 min
1

[1] 退火温度应根据Tm值较低的引物来设。

[2] 延伸时间按2min/kb来设最佳(简单模板可达20s/kb)。

3. 分析结果

将产物与loading buffer混匀后进行琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像设备观察目的条带的扩增情况。如有需要,可进行割胶回收。

无产物或产物量少的改进措施有:1调整退火温度;2减少抑制剂的影响,如提取的基因组DNA中含有抑制扩增的成分,需要高倍稀释(1: 10000)后使用;3采用乙醇沉降洗脱,提高模板DNA的纯度;4使用PCR添加剂,如PCR Enhancer、MgCl2等可提高产量。

操作注意事项

1室温下Pfu DNA聚合酶有一定的活性,为避免发生非特异性扩增,请于冰上配置反应体系,并且最后添加Pfu DNA聚合酶或模板DNA。

2 Pfu DNA聚合酶的扩增产物只有平末端,可直接用于平末端连接。如要进行TA克隆,请先进行加A反应,以提高克隆效率。(加A反应:参考如下体系,72℃,15-30min)

PCR(纯化)产物
1-7 μl
10× Taq Buffer(Mg2+Plus)
1 μl
dATP
0.2 mM
Taq DNA聚合酶
5U
超纯水
To 10 μl

3 碱基出错率是指在每个碱基合成过程中所掺入的错误核苷酸数目。Pfu DNA聚合酶的碱基错误率为1×10-6

4 dUTP、dITP和含有这些核苷酸的引物不能用于Pfu DNA聚合酶催化的PCR扩增。因为该酶与含有尿嘧啶和次黄嘌呤的DNA模板结合后会中止DNA聚合反应。

引物设计注意事项

引物长度一般在15-30个碱基之间;上下游引物3’末端避免互补,避免出现3个以上重复的G或C,或出现发夹结构,否则会产生非特异性扩增;GC含量控制在40-60%,且上下游引物GC含量尽量接近;Tm值控制在55-65℃之间,且上下游引物Tm值尽量接近,额外附加序列(酶切位点、修饰等)是非模板匹配序列,不参与Tm值计算。

    app下载分类
    联系我们
    联系人: 客服中心
    电话: 0755-25498787
    传真: 0755-25498726
    Email: sales@vanrandom.com
    微信: biocomma
    微博:
    地址: 深圳市龙岗区布吉街道甘李六路12号中海信创新产业城12栋1楼